야간 경비원 근무 첫날 밤, 박물관이 살아 움직이기 시작했다?! 엉뚱한 사업 아이템으로 하는 일 마다 늘 실패만 하는 래리 델리(벤 스틸러 분). 그를 더 이상 견뎌내지 못한 부인이 곁을 떠나자 래리는 하나 밖에 없는 아들에게만큼은 떳떳한 아버지가 되기 위해 직장을 찾아 나선다. 별 볼일 없는 그에게 온 유일한 기회는, 모든 사람들이 기피하는 자연사 박물관 야간 경비원. “아무것도 내보내지 말라”는 선배 경비원의 기이한 충고를 들은 근무 첫 날 밤, 래리는 박물관의 전시물들이 살아 움직이는 놀라운 광경을 목격한다. 밤마다 살아나는 박물관! 과연 여기에는 무슨 비밀이 있는 것일까?? 박물관 전시품들은 매일 밤 제멋대로 움직이며 래리를 괴롭힌다. 마야인들, 로마의 글래디에이터들, 카우보이들이 살아나 그들끼리의 전쟁을 벌이기 시작하고, 네안데르탈인은 자신의 디스플레이 케이스를 불태우고, 가장 포악한 공룡 티라노사우루스는 래리를 못 잡아 먹어 안달이다. 이런 대혼란 속에서 래리가 상담할 상대는 왁스 모형인 루즈벨트 대통령(로빈 윌리엄스 분)뿐. 아들을 위해 어떤 역경 속에서도 박물관을 무사히 보호해야만 하는 래리는 첫 날 선배들에게 들었던 충고가 잊혀지지 않는다. 과연 이 박물관에는 무슨 비밀이 있는 것일까?
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